Ứng dụng kỹ thuật sinh thiết và chẩn đoán một số bất thường số lượng nhiễm sắc thể của phôi sau rã đông trong quy trình thụ tinh trong ống nghiệm

Vũ Bích Thụy, Hoàng thị Diễm Tuyết, Nguyễn Khắc Hân Hoan, Phạm Việt Thanh, Dương Quốc Trọng

08/08/2011

Đặt vấn đề

Chương trình thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) được triển khai tại Việt Nam từ năm 1998 đến nay cả nước đã có hơn 9.000 đứa trẻ ra đời với tỉ lệ thành công dao động từ 26,9% đến 45% (Khoa Hiếm Muộn, BV Từ Dũ 2009-2011). Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công trong TTTON  như chất lượng của môi trường và các thành phần trong tử cung người phụ nữ, hay chất lượng của phôi được tạo nên trong môi trường TTTON. Đánh giá chất lượng phôi TTTON qua hình thái phôi là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong quy trình này nhằm chọn lựa phôi đạt chất lượng tốt để chuyển vào buồng tử cung của người phụ nữ. Tuy nhiên, nếu chỉ dựa vào các tiêu chuẩn đánh giá hình thái thì không thể phát hiện phôi mang bất thường về số lượng hay cấu trúc nhiễm sắc thể.  Do vậy, làm sao để tối ưu hóa việc chọn lọc phôi TTTON là một trong những chiến lược được quan tâm nhiều nhất  (Blake et al., 2005; Senn et al., 2006)[1] [2] hiện nay.

Kỹ thuật chẩn đoán di truyền phôi trước làm tổ  (Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD) lần đầu tiên được thực hiện vào năm 1988 bởi Handyside va cộng sự [3] bằng cách dùng phản ứng kéo dài chuỗi DNA  (Polymerase Chain Reaction, PCR) để khuếch đại một trình tự nucleotide trên nhiễm sắc thể Y để phân biệt giới tính phôi thai cho bệnh nhân mang bệnh liên kết với NST X. PGD giúp xác định tình trạng bất thường NST hoặc đột biến gen của phôi trước khi quyết định chuyển phôi vào buồng tử cung. Bệnh nhân cần được thực hiện quy trình TTTON để có phôi sử dụng trong chẩn đoán di truyền.  Mẫu sinh thiết có thể là thể cực của trứng, phôi bào của phôi ở giai đoạn phân cắt hay các tế bào nuôi của phôi nang.  Mẫu vật được lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization, FISH) để phân tích số lượng và cấu trúc NST hay mẫu vật có thể được phản ứng kéo dài chuỗi DNA  (Polymerase Chain Reaction, PCR) để phát hiện các bất thường đơn gen. Phôi mang kết quả di truyền bình thường sau đó sẽ được chuyển vào buồng tử cung của bệnh nhân [4].

PGD thường được áp dụng trên nhóm bệnh nhân lớn tuổi, điều trị TTTON thất bại nhiều lần, sẩy thai liên tiếp, BN mang bất thường cấu trúc NST dạng khảm hay chuyển đoạn, hay mang đột biến đơn gen. Các bất thường di truyền này có thể làm cho phôi không làm tổ được, sẩy thai hoặc hình thành thai mang bệnh di truyền hoặc dị tật bẩm sinh [5]. Ngày nay, việc chọn phôi có số lượng NST bình thường bằng PGD để chuyển vào buồng tử cung đã trở nên phổ biến tại nhiều trung tâm trên thế giới giúp cải thiện tỉ lệ làm tổ, tăng tỉ lệ có thai, và giảm số lượng phôi cần phải chuyển dẫn đến giảm tỉ lệ đa thai.

Tuy nhiên, đến nay quy trình thực hiện PGD vẫn chưa được triển khai tại Việt nam. Ứng dụng PGD để tầm soát các bất thường di truyền là một trong những trọng tâm phát triển của Bệnh viện Từ Dũ. Đây là đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ, do Tổng Cục Dân Số- Kế Hoạch hóa gia đình quản lý và được thực hiện bởi Khoa hiếm Muộn và Khoa Di truyền Bệnh viện Từ Dũ. Chúng  tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm đánh giá ảnh hưởng của PGD trong khảo sát bất thường số lượng NST 13, 18, 21, X, Y lên khả năng phát triển phôi và góp phần hoàn chỉnh qui trình PGD tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu

1-Xác định tỉ lệ phôi sống sau sinh thiết và tỉ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở phôi sau rã đông tạo ra từ phương pháp bơm tinh trùng vào bào tương trứng, chủ yếu là các bất thường NST 13, 18, 21, X, Y.

2- Thiết lập quy trình hoàn chỉnh về chẩn đoán bất thường số lượng nhiễm sắc thể của phôi TTTON tại Khoa Hiếm Muộn và Khoa Di truyền Bệnh viện Từ Dũ.

Phương pháp nghiên cứu

Đây là nghiên cứu tiền cứu nhằm đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật mới trong quy trình TTTON, được thực hiện từ tháng 02/2010 đến tháng 06/2011

Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên các phôi trữ lạnh của các cặp vợ chồng tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm bằng phương pháp bơm tinh trùng vào bào tương trứng tại Khoa Hiếm Muộn Từ Dũ (2002-2010) và đồng ý hiến phôi cho mục đích nghiên cứu khoa học.

 

 

Cỡ mẫu

Tỉ lệ bất thường số lượng NST  ở phôi dao động từ 32.1-70.7% [6] [7] [8] [9] [10]. Do vậy, ước tính tỷ lệ bất thường NST của phôi ước tính tối đa là 71%. Chọn tỷ lệ bất thường NST của phôi mong muốn là 50%. Độ tin cậy 95% và độ chính xác mong muốn không quá 10%. Áp dụng công thức tính cỡ mẫu và xác định được n = 45.

 

Phương pháp tiến hành

Đối tượng nghiên cứu được chọn là các phôi trữ lạnh của các cặp vợ chồng điều trị bằng phương pháp TTTON IVF/ICSI trong khoảng thời gian từ năm 2002 đến năm 2010 tại BV Từ Dũ. Toàn bộ số phôi này đã được trữ bằng phương pháp trữ chậm với môi trường 1,2-propanediol ở giai đoạn phôi phân cắt ngày 2 (4-6 phôi bào). Sau khi rã đông, phôi sống được xác định khi có trên 75% phôi bào sống. Sau đó các phôi này được cấy trong môi trường nuôi cấy phôi G-1 Plus (Vitrolife, Sweden) ở 37^oC, 6% CO₂, 5% O₂. Sau 24 giờ nuôi cấy, hình thái phôi được đánh giá lại dựa theo tiêu chuẩn của Gerris et al [11] trong đánh giá phôi giai đoạn phân cắt vào ngày 3. Phôi được chọn vào nghiên cứu khi thỏa điều kiện tăng ít nhất 1 phôi bào sau 24 giờ nuôi cấy, có ≥ 6 phôi bào và ti lệ phân mảnh dưới 20%.

Trước khi sinh thiết, phôi được ủ trong môi trường không có canxi/magné (G-PGD^TM, Vitrolife Sweden) trong 10 phút ở 37^oC. Quy trình sinh thiết được thực hiện trên kính hiển vi đảo ngược (Nikon, US) và hệ thống vi thao tác. Hệ thống laser ZILOS-tk (Hamilton Thorne, UK) và phần mềm ZILOS-tk  được sử dụng để mở cửa sổ màng zona có kích thước 30-40 µm. Kim sinh thiết (Conception Technologies-CA) được dung để lấy 1 phôi bào ra từ mỗi phôi. Phôi sau sinh thiết sẽ được nuôi cấy trong môi trường G-2 Plus (Vitrolife, Sweden) ở 37^oC, 6% CO₂, 5% O_{2 và} được đánh giá hình thái sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (ngày 4, 5, 6) dựa trên tiêu chuẩn của Gardner và Schoolcraft [12]. Phôi bào sau đó được cố định trên lam bằng dung dịch Carnoy’s (3 methanol:1 acid acetic). Lam sau đó được thực hiện lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization, Vysis MultiVysion PGT, Abbott, Đức) để chẩn đoán bất thường di truyền về số lượng NST 13, 18, 21, X, Y. Quy trình thực hiện gồm các bước chính sau: (1) Xử lý lam trước khi lai bằng dung dịch ethanol 70%, 90% và 100% trong 2 phút, (2) xử lý đoạn dò (probe) và lai ở 37^oC trong tối thiều 4 giờ, (3) Rửa lai trong dung dịch SSC và quan sát dưới kính hiển vi Carl Zeiss, Meta system (UK). Số lượng NST của phôi bào được xác định bởi số lượng tín hiệu màu sắc sau: NST 13, cho tín hiệu màu đỏ, NST 18 cho tín hiệu màu xanh biển, NST 21 cho tín hiệu màu xanh lục, NST X cho tín hiệu màu xanh dương, NST Y cho tín hiệu màu vàng. Hiệu quả của quy trình lai được kiểm chứng bởi lam chứng (MultiVysion, CEP probes (Abbott). ở mỗi chu kỳ lai huỳnh quang tại chỗ.

 

Kết quả

Có 24 cặp vợ chồng đồng ý hiến 155 phôi trữ lạnh cho nghiên cứu. Sau khi rã đông, có 85/155 (54.83%) phôi sống và được nuôi cấy trong 24 giờ. Trong đó chỉ có 48/85 (56.47%) phôi được chọn vào nghiên cứu vì thỏa điều kiện chọn vào mẫu nghiên cứu

Kết quả sinh thiết phôi và nuôi cấy phôi

Đặc điểm phôi sinh thiết được tóm tắt ở Bảng 1. Trong đó có 12.50% (6/48) phôi có trên 8 phôi bào và 29.17% (14/48) phôi được sinh thiết có tỉ lệ phân mảnh < 5%. Sau khi sinh thiết, có 91% (41/44) phôi bào được thực hiện lai FISH, do có 1  phôi bào vỡ sau sinh thiết và 3 phôi bào mất trong quá trình cố định.  Thời gian sinh thiết 1 phôi trung bình là 192 giây trung bình lá 139.30 giây/phôi (R 101-182, SD ± 25.50). Đường kính trong của cửa sổ màng zona trung bình là 25.25 µm (R20.50-30, SD ±6.71) và đường kính ngoài trung bình là 29.53 µm (R21.36-37.7 SD ±11.55).

Sau sinh thiết, toàn bộ số phôi được nuôi cấy và đánh giá hình thái sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Kết quả được tóm tắt trong Bảng 3. Kết quả cho thấy 95.83% (46/48) phôi sống sau sinh thiết (phôi sống khi  24 giờ sau sinh thiết, phôi tăng ít nhất 1 phôi bào), trong đó 56.52% (26/46) phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang và thoát màng.

Bảng 1: Đặc điểm phôi sinh thiết

Số phôi bào (pb)		Số lượng	Tỉ lệ %
	6 pb	32/48	66.67
	7 pb	10/48	20.83
	≥ 8 pb	6/48	12.50
	Tổng	48	100.00
Tỉ lệ phân mảnh của phôi (%)		Số lượng	Tỉ lệ %
	< 5	14/48	29.17
	5 10	22/48	45.83
	15-20	12/48	25.00
	Tổng	48	100.00

Bảng 2: Đặc điểm nhân phôi bào sau cố định

		Số lượng		Tỉ lệ %
		Rõ	Cô đặc	Rõ	Cô đặc
Quan sát nhân phôi bào (pb) trước lai	Nhân pb quan sát được	31/44	13/44	70.45	29.55
	Viền pb quan sát được	Rõ	Không rõ	Rõ	Không rõ
		20/44	24/44	45.45	54.55
Quan sát nhân phôi bào sau lai	Tín hiệu quan sát được	Có	Không	Có	Không
		41/44	3/44	85.42	6.25

 

Bảng 3: Đánh giá phôi phát triển sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau sinh thiết

	Số lượng	Tỉ lệ %
Phôi sống	46/48	95.83
Phôi nang thoát màng zona	26/46	56.52
Phôi ngừng phát triển ở giai đoạn phân cắt	9/46	19.57
Phôi ngừng phát triển ở giai đoạn nén	6/46	13.04
Phôi ngừng phát triển ở giai đoạn phôi nang	5/46	10.87

 

 

 

 

Kết quả lai huỳnh quang và chẩn đoán di truyền

Hiệu quả của quy trình lai được kiểm chứng bởi lam chứng (MultiVysion, CEP probes (Abbott). Kết quả cho thấy 100% chu trình lai cho kết quả tín hiệu với toàn bộ 5 NST 13, 18, 21, X, Y. Tổng hợp kết quả cho thấy có 53.66% (19/41) phôi không có kết quả di truyền ít nhất 1 cặp NST 13, 18, 21, hay X, Y, còn lại là 21.05% (4/19) phôi bình thường về 5 NST 13, 18, 21, X, Y (Bảng 4).

 

Bảng 4: Kết quả phân tích di truyền về số lượng NST

		Số lượng	Tỉ lệ %
NST 13	Không có kết quả (-,-)	6/41	14.63
	Đơn bội (13,-)	3/35	8.57
	Tam bội (13, 2x 13)	4/35	11.43
	Bình thường (13,13)	28/35	80.00
NST 18
	Không có kết quả (-,-)	4/41	9.76
	Đơn bội (18,-)	4/37	10.81
	Tam bội (18, 2x18)	3/37	8.11
	Bình thường(18,18)	30/37	81.08
NST 21
	Không có kết quả (-,-)	6/41	14.63
	Đơn bội (21,-)	5/35	14.29
	Tam bội (21, 2x 21)	4/35	11.43
	Bình thường (21,21)	26/35	74.29
NST giới tính (X, Y)
	Không có kết quả (-,-)	19/41	46.34
	Có 2 NST giới tính (X,X) (X,Y)	16/22	72.73
	Có 1 NST giới tính (X,-) (Y,-)	5/22	22.73
	Có 3 NST giới tính (XXY) (XYY) (XXX) (YYY)	1/22	4.55

Bàn luận
Quy trình sinh thiết và nuôi cấy phôi

Quá trình sinh thiết để chẩn đoán di truyền trước làm tổ trong nghiên cứu này được thực hiện ở giai đoạn phân cắt của phôi (ngày thứ 3 sau thụ tinh) Quy trình sinh thiết chung bao gồm việc sử dụng kính hiển vi đảo ngược được gắn hệ thống vi thao tác để cố định mẫu vật, mở cửa sổ màng zona pellucida, dùng kim sinh thiết để lấy mẫu vật ra khỏi trứng hay phôi. Sau đó trứng hay phôi sẽ tiếp tục được nuôi cấy, mẫu vật được cố định để chẩn đoán di truyền. Trước khi sinh thiết, phôi được ủ trong môi trường không có canxi/magné (G-PGD^TM, Vitrolife Sweden) trong 10 phút ở 37^oC. Kết quả nghiên cứu của Dumoulin và cs (1998) cho thấy thời gian ủ phôi trong môi trường này quá lâu sẽ làm ảnh hưởng đến sự phát triển tiếp theo của phôi [13]. Thời gian ủ phôi trong nghiên cứu này được giới hạn (dưới 10 phút) và phôi được rửa sạch nhiều lần trước sinh thiết.

 

Sau đó phôi được chuyển qua đĩa sinh thiết để mở cửa sổ màn zona pellucida. Đây là phương pháp tạo một lỗ ở màng bao ngoài của phôi (zona pellucida) và từ vị trí ấy, kim sinh thiết được đưa vào bên trong phôi để lấy mẫu vật ra ngoài. Nghiên cứu này dùng tia laser để mở cửa sổ màng zona, đây được xem là phương pháp đơn giản. dễ sử dụng nhất. Tuy nhiên, hiệu quả lâm sàng cũng như ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi khi dùng tia laser so với dùng phương pháp cơ học hay acid tyrode phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm, kỹ năng cũng như sự khéo léo của người thực hiện [14]. Đường kính trong trung bình và đường kính ngoài trung bình của cửa sổ màng zona trong nghiên cứu của chúng tôi là 25.25 µm (R 20.50-30, SD ±6.71) và 29.53 µm (R 21.36-37.7 SD ±11.55). Nếu cửa sổ màng zona mở quá to, toàn bộ phôi sẽ có nguy cơ thoát ra ngoài khi thao tác trên phôi hay chuyển phôi. Ngược lại, nếu cửa sổ quá nhỏ, nguy cơ song thai cùng trứng sẽ tăng. Alikani và cs (2003) báo cáo tỷ lệ song thai cùng trứng ở những ca thực hiện phương pháp hỗ trợ phôi thoát màng là 0.55% (P < 0.05)[15]. Tuy nhiên, số liệu thống kê của Cochrane 2003 [16] từ 23 thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng cho thấy chưa có mối tương quan rõ ràng giữa song thai cùng trứng và kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng. Do vậy, nguyên nhân của sự gia tăng tỷ lệ có thai là do bản thân quá trình TTTON (kích thích buồng trứng, môi trường nuôi cấy phôi…) hay do tác động lên màng zona cần được xác định qua nhiều thực nghiệm lâm sàng hơn.

Nhiều nghiên cứu trong vòng 20 năm qua cho thấy quá trình sinh thiết 1 phôi bào không  làm ảnh hưởng đến khả năng làm tổ cũng như sự phát triển của các em bé sinh ra từ phương pháp TTTON.  Nghiên cứu chúng tôi thực hiện sinh thiết 1 phôi bào/phôi và có tỉ lệ phôi bào sống và tiếp tục phân cắt sau sinh thiết là 95.83% (46/48), 2 phôi bào chết sau sinh thiết do là phôi có chất lượng xấu, có 6 phôi bào/phôi và có tỷ lệ phân mảnh 20%. Trong 46 phôi sống này, có 56.52%  (26/46) phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang và thoát màng khi đánh giá hình thái phôi sau 72 giờ sinh thiết, có 19.57% (9/46 phôi ngừng phát triển ở gia đoạn phân cắt, 13.04% (6/46) phôi ngừng phát triển ở gia đoạn nén và 10.87% (5/46) phôi không thoát màng. Kết quả của chúng tôi tương đối phù hợp khi so sánh với kết quả trong nghiên cứu của Goossen và cs (2008) [17] công bố tỷ lệ hình thành phôi nang sau sinh thiết 1 phôi bào/phôi là 51.6% (829/1608 phôi).

 

Tỉ lệ bất thường NST

Theo nghiên cứu của Magli và cs [18] (2007) khi sinh thiết 4665 phôi để thực hiện PGD-FISH, phôi có 8 phôi bào vào ngày sinh thiết (ngày 3) cho tỉ lệ bất thường số lượng NST thấp nhất (48%), so với tỉ lệ bất thường số lượng  NST của phôi có 7 phôi bào là 56% và phôi có 6 phôi bào là 71% (Hình 1). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có 21.05% (4/19) phôi bình thường về 5 NST 13, 18, 21, X, Y (Bảng 4) ở cả 3 nhóm phôi có 6,7, hay 8 phôi bào vào ngày sinh thiết. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đối phù hợp với nghiên cứu trên, tuy nhiên số lượng mẫu phôi bào chẩn đoán di truyền còn quá ít và cần được thực hiện nghiên cứu thêm trong tương lai nhằm xác định tỉ lệ bất thường 5 NST 13, 18, 21, X, Y ở phôi TTTON.

Hình 1: Bất thường số lượng NST tương ứng với các giai đoạn phát triển của phôi có ≥ 5 phôi bào quan sát lúc 62 giờ sau thụ tinh.

 

Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả phôi mang số lượng bình thường NST 13, 18, 21 lần lượt là 74.29% (26/35), 81.08% (30/37) và 80% (28/35). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu PGD của Jennifer và cs [19](2009) tại Boston IVF thực hiện trên 703 phôi TTTON của 99 bệnh nhân báo cáo tỉ lệ phôi có số lượng NST 13 bình thường dao động từ 76-79%, tỉ lệ phôi có số lượng NST  18 bình thường là 70-81% và tỉ lệ phôi có số lượng NST  21 bình thường là 22-23%.

Hạn chế của nghiên cứu chúng tôi là lượng mẫu thu thập còn quá ít (48 phôi bào được sinh thiết). Vấn đề thuyết phục bệnh nhân đồng ý  hiến phôi cho nghiên cứu thực sự rất khó khăn và phải thông qua nhiều bước thủ tục hành chính. Đồng thời, toàn bộ các phôi bệnh nhân hiến là những phôi được trữ lạnh bằng phương pháp trữ chậm trong thời gian từ 2-10 năm cũng là yếu tố cản trở làm giảm đi nguồn phôi bệnh nhân hiến tặng và phôi thỏa điều kiện được chọn vào nghiên cứu. Bên cạnh đó, kỹ thuật FISH trong PGD thực hiện chỉ trên một phôi bào duy nhất. Đây là một kỹ thuật cao, đòi hòi người thực hiện di truyền có nhiều kinh nghiệm chuyên môn trong quy trình thực hiện và phân tích kết quả. Trong bước đầu thực hiện này, tỉ lệ phôi bào không có kết quả di truyền của chúng tôi còn tương đối cao, dao động từ 9.76-14.63% cho các NST 13, 18, 21. Tuy nhiên, với điều kiện con người và cơ sở vật chất hiện tại của khoa Hiếm Muộn và Khoa Di truyền BV Từ Dũ, những nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và chẩn đoán nhiều NST hơn sẽ được thực hiện trong tương lai không xa nhằm có được kết quả chẩn đoán PGD chính xác hơn cho bệnh nhân.

Kết luận

Phương pháp chẩn đoán di truyền trước làm tổ nhằm giúp lựa chọn phôi không mang một số bất thường di truyền xác định. Sinh thiết và chẩn đoán di truyền là hai quá trình quan trong trong chẩn đoán di truyền trước làm tổ. Nghiên cứu của chúng tôi chứng minh được quá trình sinh thiết phôi không ảnh hưởng đến sự phát triển tiếp theo của phôi. 56.52%  phôi sau sinh thiết vẫn phát triển tiếp đến giai đoạn phôi nang và có thể sử dụng để chuyển vào buồng tử cung sau khi được chẩn đoán không mang bất thường di truyền xác định. Nghiên cứu này cũng xác đinh được tỉ lệ phôi trữ-rã TTTON có số lượng NST 13,18, 21, X, Y  bình thường là 21.05%. Quy trình chẩn đoán PGD tại khoa Hiếm Muộn và khoa Di Truyền BV Từ Dũ được xây dựng hoàn chỉnh và mang lại ý nghĩa thiết thực cho nhóm bệnh nhân lớn tuổi, điều trị TTTON thất bại nhiều lần, sẩy thai liên tiếp, BN mang bất thường cấu trúc NST dạng khảm hay chuyển đoạn, hay mang đột biến đơn gen.

Triển khai thành công qui trình PGD sẽ góp phần thúc đẩy sự phát triển của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam, nắm bắt được sự tiến bộ khoa học trên thế giới, đưa các kỹ thuật chẩn đoán di truyền hiện đại ứng dụng trong y học, chủ động loại bỏ các bất thường về di truyền. Điều này mang ý nghĩa rất lớn trong việc loại bỏ các gen xấu trong cộng đồng và nâng cao chất lượng dân số của Việt Nam.